可見分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。測量范圍一般包括波長范圍為380~780nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~380nm的紫外光區(qū)。
一、工作原理:
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,部分光線被吸收。樣品對光的選擇性吸收波長,以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該樣品的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū),除某些物質(zhì)對光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。
二、設(shè)備常見用途:
可見分光光度計是在可見光區(qū)域內(nèi)對物質(zhì)做定性、定量分析。常見的用途有以下幾種:
?。?)比色法蛋白質(zhì)定量
比色法的測定原理是組成蛋白質(zhì)的氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
?。?)核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。
?。?)OD600細菌細胞密度
實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。